ALCAM CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419076-ACT

Alcam kodiert das Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule (ALCAM/CD166), einen Rezeptor der Immunglobulin-Superfamilie, der homophile und heterophile Interaktionen vermittelt und so Zell-Zell-Adhäsion, Migration und Gewebeorganisation während der Mausentwicklung sowie in der Homöostase des adulten Organismus reguliert. ALCAM ist an Prozessen beteiligt, die mit Zytoskelett-Umbau und der Dynamik von Zellkontakten verknüpft sind, und beeinflusst dadurch die Integrität von Epithelien, die Axon-/Bahnsuche von Neuronen und den Verkehr von Immunzellen. Über seine adhäsionsabhängige Signalgebung kann ALCAM Signalwege modulieren, die Proliferation und Differenzierung steuern, einschließlich kontextabhängiger Effekte auf die Signalstärke (Output) von MAPK- und PI3K-AKT-Signalwegen. Eine fehlregulierte ALCAM-Expression wurde in mehreren Krankheitsmodellen mit veränderten stammzellähnlichen Eigenschaften, Invasion und metastatischem Verhalten in Verbindung gebracht, was ALCAM zu einem hilfreichen Knotenpunkt für die Untersuchung adhäsionsgetriebener phänotypischer Plastizität macht.

ALCAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Alcam-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ALCAM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Alcam-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Alcam-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ALCAM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Alcam-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ALCAM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ALCAM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Alcam-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.