Plásmido CRISPR de Activación (h) AKAP 12: sc-406008-ACT

AKAP12 (proteína de anclaje de la A-quinasa 12; gravina) es una proteína andamiaje que organiza espacialmente la señalización de PKA y PKC en la membrana plasmática y el citoesqueleto, coordinando la desensibilización de receptores, la remodelación del citoesqueleto y el control del ciclo celular. Al anclar quinasas y fosfatasas cerca de los GPCR y las integrinas, AKAP12 influye en vías que regulan la dinámica de las adhesiones focales, la migración celular y la función de barrera, con efectos posteriores sobre la señalización de MAPK y la dependiente de AMPc. La alteración de la expresión de AKAP12 y su regulación epigenética se han relacionado con cambios en programas de adhesión y motilidad celular relevantes para la biología del cáncer, la disfunción vascular y los microambientes inflamatorios. Estas propiedades convierten a AKAP12 en un nodo útil para estudiar la compartimentalización de la señalización y las respuestas transcripcionales dependientes del contexto en células humanas.

AKAP 12 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de AKAP12 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

AKAP 12 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus AKAP12 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional AKAP12, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de AKAP 12. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo AKAP12 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de AKAP 12 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía AKAP 12 en células tumorales con expresión de AKAP12 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.