Plasmide CRISPR d'Activation (h) AID: sc-401542-ACT

AICDA humain code l’enzyme deaminase des cytidines induite par l’activation (AID), une enzyme d’édition de l’ADN/ARN qui catalyse la désamination de la cytidine en uridine sur l’ADN simple brin au cours de la transcription. AID est indispensable à la diversification des anticorps via l’hypermutation somatique et la commutation de classe dans les lymphocytes B des centres germinatifs, reliant son activité à des processus de réparation de l’ADN, notamment la réparation par excision de base et la réparation des mésappariements. Une régulation stricte d’AID est nécessaire pour limiter la mutagénèse hors cible, car une expression dérégulée ou ectopique peut accroître l’instabilité génomique et contribuer aux translocations chromosomiques ainsi qu’à l’accumulation de mutations. En conséquence, AICDA est largement étudié dans les voies qui gouvernent l’immunité adaptative, la différenciation des lymphocytes B et les mécanismes de transformation oncogénique induite par les mutations.

AID Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AICDA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

AID Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AICDA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AICDA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de AID. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AICDA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de AID au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie AID dans les cellules tumorales présentant une expression de AICDA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.