ADSL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404936-ACT

Das humane Gen **ADSL** kodiert die Adenylosuccinat-Lyase, ein bifunktionales Enzym der de-novo-Purinbiosynthese, das die Spaltung von Adenylosuccinat zu AMP und Fumarat sowie die Umwandlung von SAICAR zu AICAR katalysiert. Durch diese Reaktionen unterstützt ADSL die Nukleotidhomöostase und verbindet den Purinstoffwechsel über die Fumaratbildung mit dem zentralen Kohlenstoffstoffwechsel, wodurch es die zelluläre Proliferation und den Energiehaushalt beeinflusst. Eine Störung der ADSL-Aktivität bringt die Purinnukleotid-Pools aus dem Gleichgewicht und kann metabolische Signalwege verändern, die mit der Wachstumskontrolle verknüpft sind. Varianten in **ADSL** sind mit einem Adenylosuccinat-Lyase-Mangel assoziiert, einer Stoffwechselerkrankung, die durch die Anreicherung von Succinylpurinen mit nachgelagerten Auswirkungen auf die Neuroentwicklung und die systemische Physiologie gekennzeichnet ist.

ADSL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ADSL-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ADSL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ADSL-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ADSL-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ADSL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ADSL-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ADSL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ADSL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ADSL-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.