Plasmide CRISPR d'Activation (h2) ADO: sc-408985-ACT-2

L’ADO humain (2-aminoéthanethiol dioxygénase) est une enzyme à fer non héminique qui catalyse l’oxydation dépendante de l’oxygène de la cystéamine en hypotaurine, contribuant ainsi à la biosynthèse cellulaire de la taurine et, plus largement, au métabolisme des acides aminés soufrés. En reliant le catabolisme de la cystéamine à l’homéostasie rédox et au métabolisme mitochondrial, l’activité de l’ADO s’inscrit à l’interface de voies qui régulent les réponses au stress oxydant et l’adaptation bioénergétique dans les tissus métaboliquement actifs. Un déséquilibre de l’axe taurine/hypotaurine et du métabolisme des thiols a été impliqué dans des affections associées à une dysfonction mitochondriale et à une gestion altérée des espèces réactives de l’oxygène, ce qui fait de l’ADO une cible pertinente pour des études mécanistiques. L’édition génomique ou la perturbation de l’ADO permet aux chercheurs d’examiner les flux de métabolites dérivés de la cystéamine, la biologie des dioxygénases dépendantes du fer et les effets en aval sur les phénotypes cellulaires de stress dans des systèmes modèles humains pertinents.

ADO Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ADO sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ADO Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ADO dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ADO, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ADO. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ADO natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ADO au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ADO dans les cellules tumorales présentant une expression de ADO silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.