ADAMTS-13 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402782-ACT

ADAMTS13 codifica ADAMTS-13, una metalloproteasi secreta zinco-dipendente che scinde in modo specifico i multimeri ultra-grandi del fattore di von Willebrand (VWF), regolando così l’adesione piastrinica e la formazione del trombo in condizioni di elevato stress di taglio. Controllando dimensione e distribuzione dei multimeri di VWF, ADAMTS-13 modula la proteolisi extracellulare correlata all’emostasi e le interazioni endotelio‑piastrine nel microambiente vascolare. Una ridotta attività di ADAMTS-13 o un processamento deregolato del VWF sono associati a disordini trombotici microangiopatici, rendendo ADAMTS13 un locus chiave per lo studio della biologia della coagulazione e dell’infiammazione vascolare. ADAMTS-13 offre inoltre un punto d’ingresso funzionale per analizzare i pathway che collegano l’attivazione endoteliale, la meccanobiologia dipendente dallo shear e le reti di proteasi plasmatiche.

ADAMTS-13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ADAMTS13 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ADAMTS-13 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ADAMTS13 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ADAMTS13, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ADAMTS-13. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ADAMTS13 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ADAMTS-13 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ADAMTS-13 nelle cellule tumorali con espressione di ADAMTS13 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.