Plasmide CRISPR d'Activation (h) ACO2: sc-404434-ACT

L’ACO2 humain code l’aconitase mitochondriale 2, une enzyme à centre fer‑soufre qui catalyse l’étape d’isomérisation du citrate en isocitrate dans le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA), soutenant ainsi le métabolisme oxydatif et la production de NADH nécessaire à la génération d’ATP par la respiration. En couplant le flux de carbone à l’équilibre rédox mitochondrial, ACO2 influence la gestion des espèces réactives de l’oxygène, l’anaplérose et l’adaptation métabolique à la disponibilité des nutriments. Des perturbations de l’activité d’ACO2 ont été associées à des phénotypes de dysfonctionnement mitochondrial et à des réponses au stress bioénergétique qui recoupent la neurodégénérescence, les myopathies et la reprogrammation métabolique liée au cancer. En tant que nœud central du métabolisme mitochondrial, ACO2 est fréquemment étudiée dans le contexte de la signalisation de l’hypoxie, de la capacité de phosphorylation oxydative et de la régulation, par les métabolites, de voies épigénétiques et de réponse au stress.

ACO2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACO2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ACO2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACO2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACO2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ACO2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACO2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ACO2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ACO2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACO2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.