Plasmide CRISPR d'Activation (m) Acid Ceramidase: sc-419216-ACT

Le gène murin Asah1 code la céramidase acide, une hydrolase lysosomale qui désacyle la céramide pour produire de la sphingosine et des acides gras libres, modulant l’équilibre entre le stockage et le renouvellement des sphingolipides. En régulant les pools de céramide et de sphingosine, la céramidase acide influence le trafic membranaire dépendant des lysosomes, l’autophagie et des réseaux de signalisation sensibles au stress liés à la survie cellulaire et aux réponses inflammatoires. Une perturbation de l’activité d’ASAH1 est associée à une accumulation de sphingolipides et à un dysfonctionnement lysosomal, reliant cette voie à des phénotypes neurodégénératifs et métaboliques systémiques. Asah1 constitue donc un nœud clé pour étudier la signalisation lipidique centrée sur la céramide et l’homéostasie lysosomale dans des modèles cellulaires murins et in vivo.

Acid Ceramidase Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Asah1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Acid Ceramidase Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Asah1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Asah1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Acid Ceramidase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Asah1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Acid Ceramidase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Acid Ceramidase dans les cellules tumorales présentant une expression de Asah1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.