Plásmido CRISPR de Activación (h) γENaC: sc-402577-ACT

SCNN1G codifica la subunidad γ del canal epitelial de sodio (γENaC), un canal heterotrimérico sensible a la amilorida que media la entrada electrogénica de Na⁺ a través de las membranas apicales en riñón, pulmón, colon y otros epitelios. La función de γENaC se integra con la señalización de aldosterona y vasopresina para regular el transporte transepitelial de sal y agua, lo que influye en el volumen del líquido extracelular, la homeostasis del líquido de la superficie de las vías respiratorias y el equilibrio electrolítico sistémico. La actividad del canal está controlada por el procesamiento proteolítico, el tráfico dependiente de ubiquitina mediado por NEDD4-2 y las vías celulares que regulan la permanencia en membrana y la probabilidad de apertura. La desregulación de las subunidades de ENaC, incluida SCNN1G, está implicada en trastornos del manejo de la sal y de la hidratación de las vías respiratorias, lo que respalda estudios mecanísticos en fisiología epitelial y biología del transporte iónico.

γENaC El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SCNN1G sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

γENaC El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SCNN1G en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SCNN1G, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de γENaC. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SCNN1G y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de γENaC en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía γENaC en células tumorales con expresión de SCNN1G silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.