Plasmide CRISPR d'Activation (h) β-NAP: sc-411126-ACT

Le gène humain **AP3B2** code **β‑NAP**, la sous-unité bêta enrichie dans les neurones du complexe protéique adaptateur 3 (**AP‑3**), qui assure la sélection des cargaisons et leur trafic depuis le réseau trans‑Golgi et les compartiments endosomaux vers les lysosomes et des organites apparentés. β‑NAP soutient la formation et l’adressage de vésicules essentielles à la biogenèse des vésicules synaptiques et à la sécrétion régulée, reliant AP3B2 au tri endolysosomal, à la localisation des protéines membranaires et à l’homéostasie neuronale. Une perturbation du trafic dépendant d’AP‑3 peut modifier la libération des neurotransmetteurs et la maturation des organites, faisant d’AP3B2 un nœud pertinent pour l’étude des mécanismes associés au neurodéveloppement et à la neurodégénérescence. L’expression et la fonction d’AP3B2 sont donc largement utilisées comme paramètres de lecture dans des voies impliquant le transport vésiculaire, la fonction synaptique et la dynamique endosomale‑lysosomale.

β-NAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AP3B2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

β-NAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AP3B2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AP3B2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de β-NAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AP3B2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de β-NAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie β-NAP dans les cellules tumorales présentant une expression de AP3B2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.