Plasmide CRISPR d'Activation (h) α-SNAP: sc-403996-ACT

NAPA code l’α-SNAP humain, une protéine soluble d’attachement à NSF (soluble NSF attachment protein) qui se lie aux complexes SNARE et coopère avec NSF pour provoquer, de façon ATP‑dépendante, le désassemblage des SNARE, permettant des cycles répétés d’arrimage des vésicules et de fusion membranaire. Par cette fonction de type chaperon, l’α-SNAP soutient l’exocytose constitutive et régulée, l’endocytose et le trafic Golgi‑vers‑RE, influençant ainsi la sécrétion, le recyclage des récepteurs et l’homéostasie des organites. Une perturbation du cycle des SNARE dépendant de NAPA peut altérer la protéostasie et la dynamique membranaire, des processus qui interfèrent avec la fonction synaptique et les réponses au stress. Un trafic vésiculaire dérégulé et un renouvellement anormal des complexes SNARE sont impliqués dans les mécanismes de maladies neurodégénératives et neurodéveloppementales, faisant de l’α-SNAP un nœud pertinent pour des études de voies centrées sur le transport intracellulaire.

α-SNAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NAPA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

α-SNAP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NAPA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NAPA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de α-SNAP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NAPA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de α-SNAP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie α-SNAP dans les cellules tumorales présentant une expression de NAPA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.