Wee 1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423702-ACT

Wee1 kodiert die Proteinkinase WEE1, einen konservierten Regulator des G2/M‑DNA-Schadens‑Checkpoints, der den Eintritt in die Mitose durch inhibitorische Phosphorylierung von CDK1 bremst und so den Abschluss der S‑Phase, Replikationsstress‑Antworten und die Genomintegrität koordiniert. In Mauszellen integriert WEE1 Signale von ATR/CHK1 und anderen Checkpoint‑Signalwegen, um das Timing des Zellzyklus zu modulieren, blockierte Replikationsgabeln zu stabilisieren und die Anhäufung von DNA‑Doppelstrangbrüchen zu begrenzen. Eine Störung der Wee1‑Aktivität verändert Proliferation, chromosomale Stabilität und Apoptoseprogramme, wodurch Wee1 ein häufig genutzter Knotenpunkt zur Untersuchung von Replikationsstress, Checkpoint‑Adaptation und mitosekatastrophen‑ähnlichen Phänotypen ist. Eine fehlregulierte WEE1‑Signalgebung wird häufig im Zusammenhang mit onkogen‑getriebener Beschleunigung des Zellzyklus und Abhängigkeiten von DNA‑Reparaturwegen untersucht und unterstützt mechanistische Forschung in der Krebsbiologie und Genomerhaltung.

Wee 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Wee1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Wee 1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Wee1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Wee1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Wee 1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Wee1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Wee 1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Wee 1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Wee1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.