Plásmido CRISPR de Activación (h) VPS4B: sc-403260-ACT

VPS4B codifica una ATPasa AAA+ que impulsa el desensamblaje y el reciclaje de ESCRT-III, un paso clave en la clasificación endosomal, la biogénesis de los cuerpos multivesiculares y la degradación lisosomal de proteínas de membrana. Al coordinar eventos de remodelado de membrana, VPS4B contribuye a la regulación a la baja de receptores, la citocinesis, la reparación de la membrana plasmática y la gemación de ciertos virus envueltos. La alteración de la dinámica ESCRT–VPS4 puede modificar el tráfico de carga y las salidas de señalización, vinculando las vías asociadas a VPS4B con la homeostasis celular y las respuestas al estrés relevantes para diversas enfermedades. Como regulador central del transporte mediado por vesículas, VPS4B se estudia con frecuencia en el contexto de la proteostasis, la integridad de membrana y las redes de señalización dependientes del tráfico.

VPS4B El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de VPS4B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

VPS4B El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus VPS4B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional VPS4B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de VPS4B. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo VPS4B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de VPS4B en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía VPS4B en células tumorales con expresión de VPS4B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.