VPS41 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403666-ACT

VPS41 codifica uma subunidade central do complexo de ancoragem HOPS, que coordena a fusão entre endossomos e lisossomos e a maturação do endossomo tardio por meio de interações com GTPases Rab e com a maquinaria de SNAREs. Ao favorecer a entrega de carga aos lisossomos, a VPS41 contribui para o fluxo autofágico, a downregulation (regulação negativa) de receptores e a remoção de organelas danificadas, integrando-se a redes de tráfego vesicular que mantêm a proteostase celular. A desregulação do tráfego dependente de HOPS está associada à disfunção lisossomal, à autofagia prejudicada e a saídas de sinalização alteradas — processos frequentemente implicados na neurodegeneração e na biologia de células cancerosas. Assim, a VPS41 humana é amplamente estudada em vias que regulam a homeostase endolisossomal, as respostas ao estresse e o transporte intracelular.

VPS41 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VPS41 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VPS41 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VPS41 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VPS41, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VPS41. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VPS41 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VPS41 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VPS41 em células tumorais com expressão de VPS41 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.