VIP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400776-ACT

O peptídeo intestinal vasoativo (VIP) é um hormônio neuropeptídico secretado que sinaliza principalmente por meio dos GPCRs de classe B VPAC1 (VIPR1) e VPAC2 (VIPR2), estimulando a adenilato ciclase, elevando o cAMP e ativando programas transcricionais dependentes de PKA. Em humanos, o VIP contribui para a comunicação neuroendócrina, o relaxamento do músculo liso, a regulação circadiana e neuroimune e a secreção epitelial, com efeitos a jusante sobre a sinalização de MAPK e redes de citocinas. A atividade da via do VIP é frequentemente estudada em contextos de inflamação e polarização de células imunes, fisiologia das vias aéreas e do trato gastrointestinal e neurobiologia, nos quais alterações na sinalização de VIP têm sido associadas à modulação do microambiente tumoral e a estados neuroinflamatórios. Como o VIP é rapidamente processado e atua de maneira parácrina/endócrina, a sua superexpressão controlada é útil para dissecar dinâmicas de sinalização específicas de receptores e a biologia de peptídeos secretados.

VIP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de VIP sem alterar a sequência de ADN subjacente.

VIP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus VIP em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição VIP, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de VIP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus VIP nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de VIP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via VIP em células tumorais com expressão de VIP silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.