Plasmide CRISPR d'Activation (h) VGF: sc-402030-ACT

VGF code une protéine des granules de sécrétion neuroendocrines, qui est clivée par protéolyse en peptides bioactifs régulant la plasticité synaptique, l’équilibre énergétique et la signalisation neuroendocrine. Dans les neurones et les cellules endocrines, les peptides dérivés de VGF influencent des programmes transcriptionnels dépendants de l’activité ainsi que des voies de signalisation intracellulaire liées à la sécrétion, au métabolisme et aux réponses au stress. L’expression de VGF répond aux signaux des neurotrophines et à l’activité neuronale, et elle est souvent étudiée dans le contexte de circuits contrôlant le comportement alimentaire et des phénotypes liés à l’humeur. Une signalisation VGF dérégulée a été associée à des processus pertinents pour les maladies neuropsychiatriques et métaboliques, ce qui en fait un nœud mécanistique utile dans les études d’interrogation des voies.

VGF Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VGF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VGF Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VGF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VGF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VGF. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VGF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VGF au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VGF dans les cellules tumorales présentant une expression de VGF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.