VGAT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401850-ACT

SLC32A1 kodiert den vesikulären GABA-Transporter (VGAT), ein Membranprotein synaptischer Vesikel, das GABA und Glycin in sekretorische Vesikel lädt und so inhibitorische Neurotransmission ermöglicht. Durch die Kontrolle der vesikulären Aufnahme und der Quanten-/Vesikelgröße reguliert VGAT das Gleichgewicht zwischen Erregung und Hemmung, die synaptische Plastizität sowie neuronale Netzwerkoszillationen im gesamten zentralen Nervensystem. Veränderte inhibitorische Signalübertragung, die mit einer dysregulierten SLC32A1/VGAT-Aktivität in Verbindung steht, ist relevant für Studien zu Epilepsie, angstassoziierten Phänotypen, neuroentwicklungsbedingten Störungen und Bewegungsstörungen, bei denen die Hemmung auf Schaltkreisebene beeinträchtigt ist. Als vesikulärer Transporter steht die VGAT-Funktion zudem im Zusammenhang mit dem Synapsenvesikel-Zyklus, dem Neurotransmitterstoffwechsel und ionengradientenabhängigen Transportprozessen, die die Wirksamkeit inhibitorischer Synapsen prägen.

VGAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC32A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VGAT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC32A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC32A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VGAT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC32A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VGAT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VGAT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC32A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.