VEGF CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423665-ACT

Mouse Vegfa kodiert den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), ein sezerniertes Zytokin, das die Proliferation, Migration und das Überleben von Endothelzellen reguliert, um Angiogenese und Gefäßpermeabilität zu koordinieren. Die VEGF-Signalübertragung erfolgt hauptsächlich über VEGFR2 und aktiviert die PI3K–AKT-, MAPK/ERK- und PLCγ–PKC-Kaskaden, wobei Hypoxie- und Stoffwechselsignale mit Gewebeumbauprozessen verknüpft werden. Eine fehlregulierte VEGF-Expression ist mit pathologischer Neovaskularisation, veränderter Perfusion und Änderungen im inflammatorischen Mikromilieu verbunden, die die Tumorbiologie, die Wundheilung sowie Modelle retinaler und kardiovaskulärer Erkrankungen beeinflussen. Als zentraler Knotenpunkt der Kommunikation zwischen Gefäßsystem und Stroma wird Vegfa häufig genutzt, um die Signalübertragung zwischen Endothel und Parenchym sowie den Umbau der extrazellulären Matrix zu untersuchen.

VEGF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Vegfa-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VEGF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Vegfa-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Vegfa-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VEGF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Vegfa-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VEGF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VEGF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Vegfa-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.