Plasmide CRISPR d'Activation (h) V-ATPase C1: sc-402679-ACT

ATP6V1C1 code la sous-unité C1 du domaine périphérique V1 de la H+-ATPase vacuolaire (V-ATPase), une pompe à protons dépendante de l’ATP qui acidifie les endosomes, les lysosomes et les vésicules de sécrétion. En soutenant l’acidification des organites, la V-ATPase C1 contribue à l’endocytose médiée par les récepteurs, au flux autophagique, à l’activité des enzymes lysosomales et à la signalisation de détection des nutriments par mTORC1 au niveau de la membrane lysosomale. Une altération de la fonction de la V-ATPase peut perturber l’homéostasie du pH intracellulaire, le trafic vésiculaire et la protéostasie, des processus fréquemment étudiés dans des contextes tels que la neurodégénérescence, le métabolisme des cellules cancéreuses et l’activation des cellules immunitaires. ATP6V1C1 constitue donc un nœud utile pour disséquer les voies reliant l’acidification des organites à la signalisation et aux réponses cellulaires au stress.

V-ATPase C1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ATP6V1C1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

V-ATPase C1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ATP6V1C1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ATP6V1C1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de V-ATPase C1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ATP6V1C1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de V-ATPase C1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie V-ATPase C1 dans les cellules tumorales présentant une expression de ATP6V1C1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.