V-ATPase C1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402679-ACT

ATP6V1C1 kodiert die C1‑Untereinheit der peripheren V1‑Domäne der vakuolären H+-ATPase (V‑ATPase), einer ATP‑abhängigen Protonenpumpe, die Endosomen, Lysosomen und sekretorische Vesikel ansäuert. Durch die Unterstützung der Organellenansäuerung trägt V‑ATPase C1 zur rezeptorvermittelten Endozytose, zum autophagischen Flux, zur Aktivität lysosomaler Enzyme und zur Nährstoffsensorik‑Signalgebung von mTORC1 an der lysosomalen Membran bei. Eine veränderte V‑ATPase‑Funktion kann die intrazelluläre pH‑Homöostase, den Vesikeltransport und die Proteostase stören – Prozesse, die häufig in Zusammenhängen wie Neurodegeneration, dem Metabolismus von Krebszellen und der Aktivierung von Immunzellen untersucht werden. ATP6V1C1 ist daher ein nützlicher Knotenpunkt, um Signalwege zu analysieren, die Organellenansäuerung mit Signalgebung und zellulären Stressantworten verknüpfen.

V-ATPase C1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V1C1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

V-ATPase C1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V1C1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V1C1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen V-ATPase C1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V1C1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von V-ATPase C1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des V-ATPase C1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V1C1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.