Plásmido CRISPR de Activación (m2) USP45: sc-429548-ACT-2

El gen murino Usp45 codifica USP45, una proteasa específica de ubiquitina que elimina modificaciones de ubiquitina de proteínas diana para regular su estabilidad y la salida de señalización. USP45 está implicada en la respuesta al daño del ADN, apoyando el mantenimiento del genoma mediante eventos de desubiquitinación que influyen en la elección de las vías de reparación y en la tolerancia al estrés replicativo, incluida la coordinación con redes de modificaciones postraduccionales como la señalización de ubiquitina y SUMO. La alteración de la desubiquitinación mediada por USP45 puede perturbar los procesos de reparación asociados a la cromatina, incrementar la inestabilidad genómica y se ha relacionado con fenotipos relevantes para la biología del cáncer y defectos del desarrollo. Los estudios de edición génica dirigida a Usp45 y de genómica funcional en células de ratón permiten el análisis mecanístico de los circuitos de reparación del ADN dependientes de ubiquitina, la identificación de sustratos y socios de interacción de USP45, y el modelado de relaciones genotipo–fenotipo en vías de integridad del genoma.

USP45 El plásmido de activación CRISPR (m2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Usp45 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

USP45 El plásmido de activación CRISPR (m2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Usp45 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Usp45, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de USP45. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Usp45 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de USP45 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía USP45 en células tumorales con expresión de Usp45 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.