USP18 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402259-ACT

Human USP18 kodiert die ubiquitinspezifische Peptidase 18, eine durch Interferon induzierte deISGylase, die ISG15 von Protein-Substraten entfernt und als zentraler negativer Regulator der Typ‑I‑Interferon-Signalübertragung wirkt. Durch die Modulation der ISGylierungsdynamik und die Abschwächung des Outputs des JAK–STAT-Signalwegs über Interaktionen mit IFNAR2 prägt USP18 antivirale Programme, die Zytokinantwort und die Homöostase der angeborenen Immunität. Eine veränderte USP18-Aktivität wurde mit fehlregulierten Interferon-Signaturen und inflammatorischen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird häufig in Kontexten wie viraler Restriktion, Immunflucht und Tumor‑Immun‑Interaktionen untersucht. Dadurch ist USP18 ein nützlicher Knotenpunkt, um das Zusammenspiel zwischen posttranslationaler Modifikation, transkriptionellen Interferonantworten und Proteostase zu analysieren.

USP18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen USP18-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

USP18 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des USP18-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der USP18-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen USP18-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native USP18-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von USP18-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des USP18-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem USP18-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.