UGCG CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403055-ACT

Das humane UGCG-Gen kodiert die UDP-Glukose-Ceramid-Glukosyltransferase, eine im Golgi-Apparat lokalisierte Glykosyltransferase, die den ersten festgelegten Schritt der Glycosphingolipid-Biosynthese katalysiert, indem sie Ceramid zu Glukosylceramid umsetzt. Diese Reaktion reguliert das zelluläre Ceramidgleichgewicht und unterstützt die nachgeschaltete Bildung komplexer Glycosphingolipide, die die Organisation von Membran-Mikrodomänen, Rezeptorsignale, vesikulären Transport und Zell-Zell-Interaktionen beeinflussen. Die UGCG-Aktivität greift in den Sphingolipidstoffwechsel sowie in Stressantwort-Signalwege ein und prägt dadurch Prozesse wie Differenzierung, Apoptoseanfälligkeit und inflammatorische Signalgebung. Eine gestörte Glycosphingolipid-Homöostase unter Beteiligung von UGCG wurde mit neurodegenerativen und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird zudem in onkologischen Kontexten untersucht, in denen veränderte Lipidsignalgebung Proliferation und Arzneimittelansprechen modulieren kann.

UGCG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UGCG-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UGCG Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UGCG-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UGCG-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UGCG-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UGCG-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UGCG-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UGCG-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UGCG-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.