UDP-GlcDH CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405002-ACT

UGDH kodiert die UDP-Glucose-6-Dehydrogenase (UDP-GlcDH), eine zytosolische Oxidoreduktase, die die Umwandlung von UDP-Glucose zu UDP-Glucuronsäure katalysiert – einem zentralen aktivierten Zuckernukleotid für die Biosynthese von Glykosaminoglykanen und Proteoglykanen. Durch die Bereitstellung von UDP-Glucuronsäure unterstützt UDP-GlcDH den Aufbau der extrazellulären Matrix, Programme der Zelladhäsion und -migration sowie den weiteren Glycokonjugat-Stoffwechsel, der Rezeptorsignale und Gewebeumbau beeinflusst. Eine veränderte UGDH-Aktivität wurde mit Veränderungen in der Zusammensetzung von Hyaluronan und anderen Glykosaminoglykanen in Verbindung gebracht; berichtet wurden Assoziationen mit der Invasivität von Tumorzellen, fibrosebedingtem Matrix-Remodeling und der Dynamik entzündlicher Mikroumgebungen. Als metabolischer Gatekeeper für die Interkonversion von UDP-Zuckern wird UGDH häufig in Signalwegen untersucht, die die Verfügbarkeit von Nukleotidzuckern mit Mechanotransduktion und epithelial-mesenchymalen Transitionen verknüpfen.

UDP-GlcDH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UGDH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UDP-GlcDH Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UGDH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UGDH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UDP-GlcDH-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UGDH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UDP-GlcDH-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UDP-GlcDH-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UGDH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.