UDP-GlcDH Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405002-ACT

UGDH codifica la UDP-glucosio 6-deidrogenasi (UDP-GlcDH), un’ossidoreduttasi citosolica che catalizza la conversione dell’UDP-glucosio in acido UDP-glucuronico, un nucleotide-zucchero attivato fondamentale per la biosintesi di glicosaminoglicani e proteoglicani. Fornendo acido UDP-glucuronico, la UDP-GlcDH supporta l’assemblaggio della matrice extracellulare, i programmi di adesione e migrazione cellulare e, più in generale, il metabolismo dei glicoconiugati che influenza la segnalazione dei recettori e il rimodellamento tissutale. Alterazioni dell’attività di UGDH sono state collegate a cambiamenti nella composizione dell’acido ialuronico e di altri glicosaminoglicani, con associazioni riportate con l’invasività delle cellule tumorali, il rimodellamento della matrice legato alla fibrosi e le dinamiche del microambiente infiammatorio. In quanto “gatekeeper” metabolico delle interconversioni tra UDP-zuccheri, UGDH è spesso studiato in vie che collegano la disponibilità di nucleotidi-zucchero alla meccanotrasduzione e alle transizioni epitelio-mesenchimali.

UDP-GlcDH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UGDH senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UDP-GlcDH Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UGDH nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UGDH, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UDP-GlcDH. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UGDH nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UDP-GlcDH nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UDP-GlcDH nelle cellule tumorali con espressione di UGDH silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.