UBE2D4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405030-ACT

UBE2D4 codifica uma enzima humana E2 conjugadora de ubiquitina que coopera com ligases E3 para ligar ubiquitina a proteínas-substrato, moldando sua estabilidade, localização e saída de sinalização. Por meio de seu papel no sistema ubiquitina–proteassoma, UBE2D4 contribui para a degradação proteica regulada, influenciando a progressão do ciclo celular, as respostas a danos no DNA e a proteostase sob estresse. Perturbações nas redes de ubiquitinação estão associadas a alterações na fidelidade da sinalização e ao acúmulo de proteínas mal dobradas ou aberrantes, processos frequentemente implicados na biologia do câncer e na neurodegeneração. Como um componente E2 com ampla compatibilidade com E3, UBE2D4 é útil para dissecar eventos de ubiquitinação específicos de vias e identificar substratos que controlam nós regulatórios-chave.

UBE2D4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de UBE2D4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

UBE2D4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus UBE2D4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição UBE2D4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de UBE2D4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus UBE2D4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de UBE2D4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via UBE2D4 em células tumorais com expressão de UBE2D4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.