UBC12 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403119-ACT

UBE2M kodiert das E2‑Neddylierungs‑Konjugationsenzym UBC12, eine zentrale Komponente des NEDD8‑Signalwegs, der Cullin‑RING‑Ubiquitin‑Ligasen (CRLs) durch Neddylierung von Cullinen aktiviert. Durch die Förderung der CRL‑Aktivität beeinflusst UBC12 den ubiquitinabhängigen Abbau von Regulatoren, die den Zellzyklusverlauf, die Lizenzierung der DNA‑Replikation und stressresponsive Signalwege steuern, und prägt damit die Proteostase sowie die Checkpoint‑Kontrolle. Störungen der Neddylierungsmaschinerie wurden in mehreren Krankheitskontexten mit dysregulierter Proliferation und veränderten Reaktionen auf proteotoxischen und genotoxischen Stress in Verbindung gebracht, was UBE2M zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung ubiquitinähnlicher Modifikationsnetzwerke macht. Die Funktion des humanen UBC12 ist zudem relevant für Untersuchungen von Protein‑Homöostase‑Signalwegen, die sich mit entzündlicher Signalgebung und onkogenen Transkriptionsprogrammen überschneiden.

UBC12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBE2M-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UBC12 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBE2M-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBE2M-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UBC12-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBE2M-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UBC12-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UBC12-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBE2M-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.