UBA2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404495-ACT

UBA2 kodiert die Untereinheit 2 des SUMO-aktivierenden Enzyms, die mit SAE1 ein Heterodimer bildet und so das E1-Enzym erzeugt, das die SUMOylierung einleitet, indem es SUMO adenlyliert und anschließend auf das E2-konjugierende Enzym UBC9 überträgt. Dieser Signalweg reguliert die Protein-stabilität, die subzelluläre Lokalisation und die Aktivität in zentralen Prozessen, darunter DNA-Schadenssignalisierung, Chromatinorganisation, Transkriptionskontrolle und Zellzyklusprogression. Die UBA2-abhängige SUMOylierung beeinflusst Stressantworten und die Proteostase durch Koordination mit Netzwerken ubiquitinähnlicher Modifikationen. Eine fehlregulierte Aktivität des SUMO-Signalwegs, einschließlich veränderter UBA2-Funktion oder -Expression, wurde mit onkogenen Transkriptionsprogrammen und Defekten der Genomwartung in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie sowie andere proliferations- oder stressassoziierte Phänotypen relevant sind.

UBA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UBA2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UBA2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UBA2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UBA2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UBA2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UBA2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UBA2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UBA2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UBA2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.