tsg 101 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423524-ACT

Tsg101 kodiert das Tumorsuszeptibilitätsgen 101, eine zentrale Komponente des ESCRT-I-Komplexes, der die endosomale Sortierung, die Biogenese multivesikulärer Körperchen und den ubiquitinabhängigen Transport von Membranproteinen koordiniert. In Mauszellen unterstützt tsg101 lysosomale Abbauwege, die Herunterregulation von Rezeptoren sowie Membranumbauprozesse, die mit Zytokinese und Autophagie verknüpft sind. Über seine Rolle bei der ESCRT-vermittelten Membranabschnürung beeinflusst Tsg101 die Exosomenbiogenese und das virale Budding – Prozesse, die in Modellen für Infektionen und interzelluläre Signalübertragung häufig ausgenutzt werden. Eine dysregulierte ESCRT-Funktion und eine veränderte Tsg101-Expression wurden in experimentellen Systemen mit abweichender Zellproliferation, genomischer Instabilität und onkogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch es für die Untersuchung krebsrelevanter Zellbiologie von Bedeutung ist.

tsg 101 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Tsg101-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

tsg 101 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Tsg101-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Tsg101-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen tsg 101-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Tsg101-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von tsg 101-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des tsg 101-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Tsg101-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.