tsg 101 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-423524-ACT

Tsg101 codifica o gene de suscetibilidade tumoral 101, um componente central do complexo ESCRT-I, que coordena a triagem endossomal, a biogênese de corpos multivesiculares e o tráfego de proteínas de membrana dependente de ubiquitina. Em células de camundongo, tsg101 sustenta vias de degradação lisossomal, a redução (downregulation) de receptores e eventos de remodelamento de membrana ligados à citocinese e à autofagia. Por meio de seu papel na clivagem de membrana mediada por ESCRT, Tsg101 influencia a biogênese de exossomos e o brotamento viral, processos frequentemente explorados em modelos de infecção e de sinalização intercelular. A desregulação da função do ESCRT e alterações na expressão de Tsg101 têm sido associadas a proliferação celular aberrante, instabilidade genômica e fenótipos oncogênicos em sistemas experimentais, tornando-o relevante para o estudo da biologia celular relacionada ao câncer.

tsg 101 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Tsg101 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

tsg 101 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Tsg101 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Tsg101, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de tsg 101. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Tsg101 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de tsg 101 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via tsg 101 em células tumorais com expressão de Tsg101 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.