Plasmide CRISPR d'Activation (h) Tropomyosin β: sc-401580-ACT

TPM2 code la tropomyosine bêta humaine, une protéine en coiled-coil se liant à l’actine, qui polymérise le long de l’actine filamentaire afin de réguler la stabilité des filaments fins et l’accès des moteurs de myosine à l’actine. En modulant la contractilité actomyosine, la tropomyosine bêta contribue à l’organisation du cytosquelette, à la dynamique des sarcomères et des fibres de stress, ainsi qu’aux voies qui gouvernent la forme cellulaire, la migration et la mécanotransduction. L’expression de TPM2 et l’équilibre entre ses isoformes influencent la spécialisation des filaments d’actine musculaires et non musculaires, la reliant à des processus tels que la myofibrillogenèse et le remodelage du cytosquelette. Des altérations génétiques de TPM2 ont été associées à des myopathies congénitales et à des phénotypes de rétractions (contractures), ce qui en fait une cible pertinente pour étudier la régulation des filaments d’actine dans des modèles cellulaires pertinents pour la maladie.

Tropomyosin β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TPM2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Tropomyosin β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TPM2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TPM2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Tropomyosin β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TPM2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Tropomyosin β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Tropomyosin β dans les cellules tumorales présentant une expression de TPM2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.