TRB-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403132-ACT

Humanes TRIB2 (TRB-2) kodiert eine Pseudokinase, die als Adapter-/Gerüstprotein fungiert und die Signaltransduktion reguliert, anstatt Phosphorylierungen zu katalysieren. TRB-2 moduliert MAPK/ERK- und PI3K/AKT-assoziierte Programme und greift in die Ubiquitin-Proteasom-Kontrolle von Transkriptionsfaktoren wie Proteinen der C/EBP-Familie ein, wodurch Differenzierung, Proliferation und Stressantworten geprägt werden. Eine veränderte TRIB2-Expression wurde mit einer dysregulierten hämatopoetischen und myeloischen Differenzierung in Verbindung gebracht und wird in der Krebsbiologie häufig untersucht, wo sie zu Abhängigkeiten von onkogenen Signalwegen beiträgt. Diese Eigenschaften machen TRIB2 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um das Zusammenspiel von Signalwegen zu untersuchen, das Zellschicksalsentscheidungen und das Überleben unter Stress steuert.

TRB-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TRIB2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TRB-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TRIB2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TRIB2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TRB-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TRIB2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TRB-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TRB-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TRIB2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.