Plasmide CRISPR d'Activation (h) transgelin: sc-401343-ACT

TAGLN code la transgéline, une protéine se liant à l’actine, enrichie dans les cellules musculaires lisses, qui stabilise et regroupe l’actine filamentaire afin de soutenir l’architecture du cytosquelette, la contractilité et la forme cellulaire. La transgéline participe au remodelage du cytosquelette d’actine en aval de RhoA/ROCK et de programmes de mécanotransduction apparentés qui coordonnent l’adhésion et la migration. Les variations d’expression de TAGLN sont fréquemment utilisées comme marqueur de la différenciation des cellules musculaires lisses et de la transition phénotypique lors du remodelage vasculaire et de processus associés à la fibrose. Des niveaux dérégulés de transgéline ont également été rapportés dans la biologie du stroma associé aux tumeurs et dans des états cellulaires invasifs, reliant la reprogrammation du cytosquelette à des comportements cellulaires pertinents pour la maladie.

transgelin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TAGLN sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

transgelin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TAGLN dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TAGLN, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de transgelin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TAGLN natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de transgelin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie transgelin dans les cellules tumorales présentant une expression de TAGLN silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.