Transaldolase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402807-ACT

Das humane TALDO1 kodiert die Transaldolase, ein Schlüsselenzym des nicht-oxidativen Zweigs des Pentosephosphatwegs, das Zuckerphosphate ineinander überführt, um die Produktion von Ribose-5-phosphat mit glykolytischen Intermediaten auszubalancieren. Über diese Funktion unterstützt TALDO1 die Nukleotidbiosynthese, indirekt über den Fluss durch den Signalweg die Redoxhomöostase sowie die zelluläre Anpassung an oxidativen und metabolischen Stress. Eine veränderte Transaldolase-Aktivität wurde mit angeborenen Stoffwechselstörungen und weiterreichenden Beeinträchtigungen der hepatozellulären Funktion, der Immunregulation und von Signalwegen für oxidativen Schaden in Verbindung gebracht. Als metabolischer Knotenpunkt wird TALDO1 häufig in Kontexten untersucht, in denen eine Umprogrammierung des Pentosephosphatwegs Proliferation, Differenzierung und Stressantworten beeinflusst.

Transaldolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TALDO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Transaldolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TALDO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TALDO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Transaldolase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TALDO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Transaldolase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Transaldolase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TALDO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.