Plásmido CRISPR de Activación (h) TPCN1: sc-404943-ACT

El TPCN1 (canal de dos poros 1) humano codifica un canal catiónico endolisosomal que regula la liberación de Ca2+ sensible a NAADP desde orgánulos ácidos, coordinando microdominios de calcio intracelulares con el tráfico de membranas. Al modular la dinámica endosoma–lisosoma, la fusión vesicular y la excitabilidad de los orgánulos, TPCN1 influye en la autofagia, el reciclaje de receptores y vías de señalización vinculadas al metabolismo celular y a las respuestas al estrés. Las alteraciones en el manejo endolisosomal de Ca2+ y los fenotipos de tráfico asociados a la actividad de TPCN1 son relevantes para investigaciones sobre neurodegeneración, disfunción cardiometabólica y mecanismos de entrada de patógenos en el hospedador. En consecuencia, TPCN1 se estudia con frecuencia en modelos que conectan la función lisosomal con la transducción de señales dependiente de Ca2+ y la proteostasis.

TPCN1 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TPCN1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TPCN1 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TPCN1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TPCN1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TPCN1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TPCN1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TPCN1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TPCN1 en células tumorales con expresión de TPCN1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.