TP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404178-ACT

Human TEP1 kodiert das Telomerase-assoziierte Protein 1 (TP1), eine zentrale Komponente der Telomerase- und Telomererhaltungsmaschinerie, die den Schutz der Chromosomenenden und die langfristige Replikationsfähigkeit unterstützt. TP1 trägt zur Assemblierung und Stabilität des Telomerase-RNP-Komplexes bei und verknüpft die Telomerbiologie mit Signalwegen der Genomintegrität, einschließlich DNA-Schadenssignalgebung und Zellzykluskontrolle. Eine Fehlregulation telomerase-assoziierter Faktoren und der Telomerhomöostase wird mit altersassoziierten Phänotypen und mehreren Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, die durch genomische Instabilität gekennzeichnet sind. TEP1 wird daher in Modellen von proliferativem Stress, Seneszenz und telomergetriebenen Veränderungen in Transkriptionsprogrammen untersucht.

TP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TEP1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TEP1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TEP1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TEP1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TEP1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.