TORC2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402481-ACT

Humanes CRTC2 (TORC2) ist ein von CREB regulierter Transkriptions-Koaktivator, der cAMP/PKA- und Calcium-Signale mit Programmen der metabolischen Genexpression integriert. Indem TORC2 CREB mit Promotor-/Enhancer-Aktivität koppelt, trägt es zur Kontrolle der transkriptionellen Outputs der Glukoneogenese und des Lipidstoffwechsels bei und unterstützt adaptive Antworten wie Energiebilanz und Stresssignalgebung. Seine Aktivität wird durch phosphorylierungsabhängige zytoplasmatische Sequestrierung und nukleäre Translokation moduliert und verknüpft so upstream-Kinasewege mit der transkriptionellen Steuerung. Eine Fehlregulation der CRTC2-Signalgebung wurde mit einer veränderten metabolischen Homöostase und Störungen in transkriptionellen Netzwerken in Verbindung gebracht, die für metabolische und proliferative Phänotypen relevant sind.

TORC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CRTC2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TORC2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CRTC2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CRTC2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TORC2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CRTC2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TORC2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TORC2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CRTC2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.