Plásmido CRISPR de Activación (h2) TM9SF4: sc-406168-ACT-2

El gen humano TM9SF4 (miembro 4 de la superfamilia transmembrana 9) codifica una proteína multipaso de membrana enriquecida en compartimentos endosomales/lisosomales, donde contribuye al tráfico vesicular, la acidificación de orgánulos y el recambio de proteínas de membrana. TM9SF4 se ha vinculado con la regulación de la endocitosis y de las vías de autofagia-lisosoma, influyendo en la homeostasis celular y en las respuestas al estrés mediante el control del pH intracelular y la clasificación de la carga. La alteración de la expresión o la función de TM9SF4 se ha asociado con fenotipos de supervivencia de células tumorales y con contextos de señalización relacionados con el sistema inmunitario, lo que la hace relevante para el estudio de la biología de las células cancerosas y la adaptación al microambiente. La edición génica de TM9SF4 permite la investigación mecanística de la dinámica endolisosomal, la proteostasis dependiente del pH y los efectos posteriores sobre el reciclaje de receptores, la detección de nutrientes y las transiciones de estado celular en modelos de células humanas.

TM9SF4 El plásmido de activación CRISPR (h2) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TM9SF4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TM9SF4 El plásmido de activación CRISPR (h2) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TM9SF4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TM9SF4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TM9SF4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TM9SF4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TM9SF4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TM9SF4 en células tumorales con expresión de TM9SF4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.