Plasmide CRISPR d'Activation (m) TIGAR: sc-435668-ACT

Le gène murin *Tigar* code TIGAR (régulateur de la glycolyse et de l’apoptose induit par TP53), une enzyme de type fructose-2,6-bisphosphatase qui détourne le flux carboné cellulaire de la glycolyse vers la voie des pentoses phosphates en abaissant les niveaux de fructose-2,6-bisphosphate. En augmentant la production de NADPH et en réduisant les espèces réactives de l’oxygène (ROS), TIGAR contribue à l’homéostasie rédox, influence la fonction mitochondriale et module l’apoptose ainsi que l’autophagie en réponse à un stress métabolique ou génotoxique. L’activité de TIGAR s’inscrit à l’interface entre la signalisation du stress dépendante de p53, le contrôle de la glycolyse et les défenses antioxydantes, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude du remodelage métabolique, des réponses inflammatoires au stress et des dommages oxydatifs dans des phénotypes cellulaires associés aux maladies. Dans des modèles murins, la perturbation de l’expression de TIGAR est utilisée pour examiner comment le métabolisme du glucose et la capacité de tamponnement des ROS façonnent la survie cellulaire, la prolifération et l’adaptation tissulaire.

TIGAR Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Tigar sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TIGAR Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Tigar dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Tigar, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TIGAR. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Tigar natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TIGAR au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TIGAR dans les cellules tumorales présentant une expression de Tigar silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.