Plasmide CRISPR d'Activation (m) Thrombospondin 1: sc-423381-ACT

Thbs1 code la thrombospondine 1, une glycoprotéine matricellulaire sécrétée qui module les interactions cellule–matrice et remodèle le microenvironnement extracellulaire. Dans les tissus de souris, THBS1 influence l’angiogenèse et l’homéostasie vasculaire, en partie via des interactions avec CD36 et les intégrines, et en régulant l’activation de la signalisation TGF-β latente. Elle façonne l’adhérence et la migration cellulaires ainsi que le dialogue inflammatoire, reliant la dynamique de la matrice extracellulaire aux programmes de réparation des plaies et de remodelage tissulaire. Une expression dérégulée de THBS1 a été associée à la fibrose, aux interactions tumeur–stroma et à des pathologies vasculaires, ce qui en fait un nœud pertinent pour l’étude de phénotypes dépendants du microenvironnement.

Thrombospondin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Thbs1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Thrombospondin 1 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Thbs1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Thbs1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Thrombospondin 1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Thbs1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Thrombospondin 1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Thrombospondin 1 dans les cellules tumorales présentant une expression de Thbs1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.