Plasmide CRISPR d'Activation (h) TDP1: sc-405057-ACT

La tyrosyl-ADN phosphodiestérase 1 (TDP1) est une enzyme de réparation de l’ADN qui résout les complexes covalents topoisomérase I–ADN bloqués en hydrolysant les liaisons 3′-phosphotyrosyle, rétablissant des extrémités d’ADN ligatables lors de la réparation des cassures simple brin. Cette activité soutient la stabilité du génome en situation de stress de transcription et de réplication et s’articule avec des voies coordonnées par PARP1, XRCC1 et la ligase III de l’ADN pour traiter des intermédiaires oxydatifs et de ligation avortée. Une altération de la fonction de TDP1 perturbe la réparation des lésions induites par les topoisomérases et a été associée à la neurodégénérescence ainsi qu’à une sensibilité accrue aux agents endommageant l’ADN, soulignant sa pertinence pour l’étude du maintien neuronal et des réponses au stress génotoxique. En biologie du cancer et en biologie des chromosomes, TDP1 est fréquemment étudiée pour son rôle dans la tolérance aux dommages de l’ADN, l’intégrité des fourches de réplication et la réparation des cassures d’ADN associées à la transcription.

TDP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TDP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TDP1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TDP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TDP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TDP1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TDP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TDP1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TDP1 dans les cellules tumorales présentant une expression de TDP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.