TCP-1 ζ Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403047-ACT

CCT6A codifica a subunidade zeta do chaperonina contendo TCP-1 (TCP-1 ζ) humana, um componente central do complexo citosólico TRiC/CCT que medeia o dobramento dependente de ATP da actina, da tubulina e de outras proteínas cliente necessárias para a proteostase. Por meio do seu papel no controlo de qualidade proteica, a TCP-1 ζ sustenta a organização do citoesqueleto, a progressão do ciclo celular e a homeostase responsiva ao stress, com efeitos a jusante em processos como a integridade do fuso mitótico e o tráfego intracelular. A perturbação de subunidades do TRiC/CCT pode remodelar redes de sinalização ligadas à proliferação e à sobrevivência, e já foi reportada expressão alterada de CCT6A em múltiplos contextos relevantes para a doença, incluindo fenótipos associados ao cancro e desequilíbrio da proteostase. Como resultado, CCT6A é frequentemente estudado em vias que ligam a capacidade de chaperonas, a dinâmica do citoesqueleto e a aptidão celular sob stress.

TCP-1 ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CCT6A sem alterar a sequência de ADN subjacente.

TCP-1 ζ O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CCT6A em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CCT6A, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de TCP-1 ζ. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CCT6A nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de TCP-1 ζ no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via TCP-1 ζ em células tumorais com expressão de CCT6A silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.