Plasmide CRISPR d'Activation (h) TBC1D24: sc-404561-ACT

TBC1D24 code une protéine contenant un domaine TBC, impliquée dans la régulation du trafic membranaire et de la dynamique des vésicules, des processus qui soutiennent la fonction synaptique et d’autres voies de sécrétion à forte demande. Bien que son domaine TBC soit atypique par rapport aux protéines canoniques d’activation de l’activité GTPasique (GAP) des Rab, TBC1D24 a été associée au contrôle du tri endosomal, du cycle des vésicules synaptiques et au maintien de l’homéostasie cellulaire en situation de stress oxydant. Dans les neurones, ces voies s’entrecroisent avec la signalisation dépendante de l’activité et le renouvellement des organites, qui influencent l’excitabilité et la stabilité des réseaux. Les variations génétiques de TBC1D24 sont associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et épileptiques, ce qui motive des études mécanistiques des effets dépendants de la dose et du contexte dans des modèles cellulaires pertinents.

TBC1D24 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de TBC1D24 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TBC1D24 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus TBC1D24 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription TBC1D24, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TBC1D24. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus TBC1D24 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TBC1D24 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TBC1D24 dans les cellules tumorales présentant une expression de TBC1D24 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.