STAM Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402697-ACT

La STAM (signal transducing adaptor molecule) umana è un adattatore endosomiale che opera all’interno del complesso ESCRT-0, in associazione con HGS/Hrs, per riconoscere i carichi ubiquitinati e coordinare lo smistamento dei recettori verso la degradazione lisosomiale. Attraverso i suoi domini VHS e SH3, STAM integra il traffico dipendente dall’ubiquitina con la modulazione a valle della segnalazione dei recettori di fattori di crescita e citochine, influenzando l’ampiezza e la durata delle vie MAPK e JAK/STAT. Questa regolazione è centrale per l’endocitosi, la maturazione degli endosomi e la proteostasi, processi spesso alterati nella biologia del cancro e nella segnalazione immunitaria. Un turnover dei recettori dipendente da STAM deregolato è stato associato a una persistenza anomala dei segnali e a una risposta cellulare modificata, rendendo STAM un nodo utile per analizzare il crosstalk tra traffico e segnalazione.

STAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di STAM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

STAM Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus STAM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione STAM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di STAM. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus STAM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da STAM nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via STAM nelle cellule tumorali con espressione di STAM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.