STAM Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402697-ACT

A STAM humana (signal transducing adaptor molecule) é um adaptador endossomal que atua no complexo ESCRT-0, em parceria com HGS/Hrs, para reconhecer cargas ubiquitinadas e coordenar a triagem de receptores em direção à degradação lisossomal. Por meio de seus domínios VHS e SH3, a STAM integra o tráfego dependente de ubiquitina com a modulação a jusante da sinalização de receptores de fatores de crescimento e citocinas, influenciando a amplitude e a duração das vias MAPK e JAK/STAT. Essa regulação é central para a endocitose, a maturação de endossomos e a proteostase, processos frequentemente alterados na biologia do câncer e na sinalização imune. A desregulação da renovação (turnover) de receptores dependente de STAM tem sido associada à persistência anômala de sinais e à responsividade celular alterada, tornando a STAM um nó útil para dissecar o crosstalk entre tráfego e sinalização.

STAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de STAM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

STAM O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus STAM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição STAM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de STAM. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus STAM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de STAM no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via STAM em células tumorais com expressão de STAM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.