SRY CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404342-ACT

SRY (sex-determining region Y) kodiert einen Transkriptionsfaktor mit HMG-Box (High-Mobility-Group-Box), der die männliche Geschlechtsdetermination einleitet, indem er während der Embryogenese die Differenzierung von Sertoli-Zellen und die Hodenentwicklung steuert. SRY bindet an DNA und krümmt sie, um Genexpressionsprogramme zu regulieren; dabei aktiviert es besonders SOX9 und koordiniert nachgeschaltete Wege der gonadalen Differenzierung, die die Entwicklung des Reproduktionstrakts prägen. Eine fehlregulierte SRY-Expression oder Sequenzvariationen sind mit Störungen der Geschlechtsentwicklung (Disorders of Sex Development, DSD) assoziiert, darunter Gonadendysgenesie und Phänotypen der Geschlechtsumkehr, und SRY wird zudem in vielfältigen experimentellen Kontexten als abstammungs- und geschlechtsspezifischer Marker verwendet. Da SRY als Master-Regulator fungiert, bietet die Modulation seiner Aktivität einen direkten Ansatzpunkt, um transkriptionelle Netzwerke zu untersuchen, die Zellschicksalsentscheidungen steuern.

SRY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SRY-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SRY Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SRY-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SRY-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SRY-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SRY-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SRY-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SRY-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SRY-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.