Plasmide CRISPR d'Activation (h) SRp75: sc-401964-ACT

Le gène humain **SRSF4** code le facteur d’épissage riche en sérine/arginine **SRp75**, une protéine liant l’ARN qui coordonne le choix des sites d’épissage et l’épissage alternatif des pré-ARNm. SRp75 participe à l’assemblage du spliceosome et couple les décisions d’épissage à la transcription et à l’export des ARNm, influençant la diversité du protéome et les transitions d’état cellulaire. En régulant l’inclusion des exons et l’équilibre des isoformes, SRSF4 affecte des voies qui gouvernent la progression du cycle cellulaire, les programmes de différenciation et l’expression génique en réponse au stress. Des réseaux d’épissage dérégulés impliquant les protéines SR, dont SRp75, sont associés à un remodelage du transcriptome lié aux maladies et sont fréquemment étudiés dans le contexte de la signalisation oncogénique et des pathologies neurodégénératives.

SRp75 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SRSF4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SRp75 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SRSF4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SRSF4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SRp75. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SRSF4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SRp75 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SRp75 dans les cellules tumorales présentant une expression de SRSF4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.