Plásmido CRISPR de Activación (m) SPRED2: sc-431133-ACT

Spred2 codifica SPRED2, una proteína adaptadora relacionada con Sprouty que regula negativamente la señalización de receptores tirosina quinasa al restringir la cascada RAS–RAF–MEK–ERK/MAPK. Mediante interacciones con RAF y con complejos de señalización asociados, SPRED2 ayuda a modular respuestas inducidas por factores de crecimiento, como la proliferación, la diferenciación, la migración y la expresión de genes inflamatorios. En sistemas murinos, la alteración de la actividad de SPRED2 se ha relacionado con una desregulación de la dinámica de la señalización MAPK y con cambios posteriores en la homeostasis inmunitaria y tisular. Como “freno” de la vía, SPRED2 se estudia con frecuencia en contextos en los que la amplitud y la duración de la señalización de ERK influyen en fenotipos relevantes para modelos de transformación oncogénica, biología vascular y patologías asociadas a la inflamación.

SPRED2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Spred2 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SPRED2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Spred2 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Spred2, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SPRED2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Spred2 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SPRED2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SPRED2 en células tumorales con expresión de Spred2 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.