SPPL2b CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405646-ACT

Das humane SPPL2B kodiert die intramembranäre aspartylprotease SPPL2b, ein signalpeptidaseähnliches Enzym, das ausgewählte Typ‑II‑Membranproteine innerhalb der Lipiddoppelschicht spaltet. Durch die Regulation des Substratumsatzes und der Signalgebung von Membranproteinfragmenten trägt SPPL2b zur Proteostase, zum endosomalen/lysosomalen Transport sowie zu rezeptorassoziierten Verarbeitungsvorgängen bei, die die Zellkommunikation prägen. Die Aktivität von SPPL2b überschneidet sich mit Signalwegen, die die Qualitätskontrolle von Proteinen und immunrelevante Membrandynamiken steuern, was sie für Studien zur Entzündungsregulation und Neurobiologie relevant macht, in denen intramembranäre Proteolyse Signalausgänge modulieren kann. Eine fehlregulierte Verarbeitung und der Transport von Membranproteinen werden häufig mit komplexen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wodurch SPPL2B einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Untersuchungen in krankheitsrelevanten Zellmodellen darstellt.

SPPL2b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPPL2B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPPL2b Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPPL2B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPPL2B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPPL2b-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPPL2B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPPL2b-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPPL2b-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPPL2B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.