SphK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401274-ACT

Das humane Gen **SPHK1** kodiert die Sphingosinkinase 1 (SphK1), eine zytosolische Lipidkinase, die Sphingosin phosphoryliert und dadurch Sphingosin-1-phosphat (S1P) erzeugt – ein bioaktives Sphingolipid, das den metabolischen Status mit Signalausgängen koppelt. Indem SphK1 den Sphingolipid‑„Rheostat“ in Richtung S1P verschiebt, beeinflusst sie Membrantransportprozesse, calciumabhängige Signalübertragung sowie die nachgeschaltete Aktivität der MAPK/ERK-, PI3K/AKT- und NF-κB-Signalwege – sowohl durch intrazelluläre Wirkungen als auch über S1P‑Rezeptor‑abhängige Signalgebung. Die Regulation von SPHK1 wurde in unterschiedlichen zellulären Kontexten mit Entzündungsreaktionen, Stressanpassung, angiogener Signalgebung und Programmen der Zellmotilität in Verbindung gebracht. Veränderte SPHK1/S1P-Signalgebung wird häufig in der Krebsbiologie sowie in Modellen für Fibrose und immunvermittelte Erkrankungen untersucht, in denen ein Sphingolipid‑Remodeling Proliferation, Überleben und die Kommunikation mit dem Mikromilieu beeinflusst.

SphK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPHK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SphK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPHK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPHK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SphK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPHK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SphK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SphK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPHK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.