SphK1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401274-ACT

O SPHK1 humano codifica a esfingosina quinase 1 (SphK1), uma quinase lipídica citosólica que fosforila a esfingosina para gerar esfingosina-1-fosfato (S1P), um esfingolipídeo bioativo que conecta o estado metabólico às saídas de sinalização. Ao deslocar o “reostato” dos esfingolipídeos em direção à S1P, a SphK1 influencia o tráfego de membranas, a sinalização dependente de cálcio e a atividade a jusante das vias MAPK/ERK, PI3K/AKT e NF-κB por meio de ações intracelulares e de sinalização dependente de receptores de S1P. A regulação de SPHK1 tem sido associada a respostas inflamatórias, adaptação ao estresse, sinalização angiogênica e programas de motilidade celular em diversos contextos celulares. A sinalização SPHK1/S1P alterada é frequentemente investigada em biologia do câncer, fibrose e modelos de doenças imunomediadas, nos quais a remodelação de esfingolipídeos afeta proliferação, sobrevivência e a comunicação com o microambiente.

SphK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SPHK1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

SphK1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SPHK1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SPHK1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de SphK1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SPHK1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de SphK1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via SphK1 em células tumorais com expressão de SPHK1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.