Plasmide CRISPR d'Activation (h) spectrin β III: sc-402980-ACT

SPTBN2 code la spectrine βIII humaine, un échafaudage cytosquelettique qui forme des hétérotétramères avec les α-spectrines afin de stabiliser les réseaux d’actine corticaux et d’organiser les microdomaines membranaires. La spectrine βIII contribue au maintien de la forme cellulaire et de la résistance mécanique, tout en coordonnant le trafic et la localisation des canaux ioniques, des récepteurs et des complexes de signalisation, reliant la dynamique du cytosquelette à des processus tels que la croissance des neurites et l’organisation synaptique. Dans les neurones, SPTBN2 est particulièrement important pour le développement du cervelet et la fonction des cellules de Purkinje, et sa dérégulation est associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Ces propriétés font de SPTBN2 un nœud pertinent pour étudier la signalisation liée au cytosquelette, la compartimentation des protéines membranaires et les réponses au stress dépendant de l’architecture actine–spectrine.

spectrin β III Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPTBN2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

spectrin β III Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPTBN2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPTBN2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de spectrin β III. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPTBN2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de spectrin β III au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie spectrin β III dans les cellules tumorales présentant une expression de SPTBN2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.