SPA-L3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-411666-ACT

Das humane Gen **SIPA1L3** kodiert **SPA-L3**, ein multidomaines Signalgerüstprotein (Scaffold), das mit regulatorischen Netzwerken kleiner GTPasen interagiert und Proteinkomplexe an der Plasmamembran sowie am kortikalen Zytoskelett organisiert. Durch die Assoziation mit Komponenten des Rap/Ras-Signalwegs und aktin-gekoppelten Komplexen ist SPA-L3 so positioniert, dass es Zellpolarität, Adhäsion und die dynamische Umstrukturierung des Zytoskeletts beeinflussen kann, die Migration und Morphogenese prägen. Eine veränderte Regulation dieser Prozesse ist häufig mit invasivem Verhalten und abweichender Gewebearchitektur verbunden, wodurch **SIPA1L3** ein nützlicher Genort ist, um das „Rewiring“ von Signalwegen in krankheitsrelevanten Zellzuständen zu untersuchen. Expression und Netzwerk-Konnektivität von **SIPA1L3** sind daher in Modellen informativ, die membrannahe Signalübertragung, zytoskelettale Kontrolle und phänotypische Plastizität analysieren.

SPA-L3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIPA1L3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPA-L3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIPA1L3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIPA1L3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPA-L3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIPA1L3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPA-L3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPA-L3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIPA1L3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.