Six2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-402975-ACT

SIX2 codifica o fator de transcrição homeobox Six2, um regulador do desenvolvimento que mantém a identidade de células progenitoras e controla programas de especificação de linhagem. Em tecidos humanos, redes transcricionais dirigidas por Six2 influenciam a diferenciação mesenquimal, as interações epitélio–mesênquima e vias associadas à organogênese, com efeitos a jusante no timing do ciclo celular e na manutenção do estado da cromatina. A expressão desregulada de SIX2 tem sido associada a programas gênicos de desenvolvimento alterados e foi relatada em contextos de proliferação e diferenciação aberrantes, tornando-o relevante para estudos mecanísticos de distúrbios do desenvolvimento e de reprogramação transcricional oncogênica. Como regulador de ligação ao DNA, Six2 é frequentemente usado como um nó para investigar circuitos de controle transcricional e decisões de destino celular em modelos de células-tronco e progenitoras.

Six2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de SIX2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Six2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus SIX2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição SIX2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Six2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus SIX2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Six2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Six2 em células tumorais com expressão de SIX2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.