Plásmido CRISPR de Activación (h) SIRT3: sc-400675-ACT

La SIRT3 humana codifica una desacetilasa mitocondrial dependiente de NAD+ que regula la acetilación de proteínas para coordinar el metabolismo oxidativo, la biogénesis mitocondrial y la homeostasis redox. Al desacetilar dianas implicadas en la oxidación de ácidos grasos, el ciclo del TCA y la función de la cadena de transporte de electrones, SIRT3 influye en la producción de ATP, la desintoxicación de ROS y las vías de control de calidad mitocondrial, como la mitofagia. La actividad de SIRT3 vincula la detección de nutrientes y las respuestas al estrés con programas de supervivencia celular, con efectos aguas abajo sobre la señalización AMPK/PGC-1α y las defensas antioxidantes, incluida la amortiguación de ROS dependiente de SOD2. La expresión o actividad desregulada de SIRT3 se ha asociado con fenotipos de disfunción mitocondrial relevantes para la biología de las enfermedades metabólicas, la investigación en neurodegeneración y los estudios del metabolismo del cáncer.

SIRT3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SIRT3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SIRT3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SIRT3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SIRT3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SIRT3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SIRT3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SIRT3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SIRT3 en células tumorales con expresión de SIRT3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.